-年中国光学玻璃制造行业监测与发展趋势研究报告 19页

I型内皮素受体反义寡聚核苷酸抑制VSMC增殖及内膜增生作者：钱济先，张柏根，李桂云，张岚，邓廉夫，朱雅萍【关键词】内皮素关键词:内皮素;反义寡核苷酸;血管平滑肌细胞摘要:目的观察Ⅰ型内皮素受体反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖和内膜增生的抑制作用.方法①细胞培养:取家兔主动脉中膜消化后培养传代，经抗α-actin鉴定后使用第4～6代传代细胞;②人工合成ODN:经Genbank检索筛选，合成含18bpETA-ODN片段，再对5"端硫代修饰以增加稳定性，同时行地高辛标记以检测反义片∠段的细胞膜穿透性;③MTT分光光度法司检测ETA-ODN对VSMC增殖的抑蓠制作用;④运用放射受体结合分析法了解菇ODN对ETA蛋白表达的抑制作用，以幂探讨其反义作用;⑤兔颈动脉空气干燥模岑型在体研究ODN对血管内膜增生的抑制满作用:应用F-127凝胶载体携带ETA-ODN导入血管周围，术后不同时间旦观察增生内膜相对厚度.结果ODN于培腐养后12h进入细胞内，并逐渐增加;1η19/19 5μmolL-1ETA-ODN对VS嗜MC增殖具有抑制作用，24h后即有显玻著作用;ETA-ODN对ETA表达亦磺有明显的抑制作用，表现为CPM于24┑h逐渐减少;ETA-ODN导入后，血管增生内膜相对厚度减少.结论ETA-骀ODN以浓度和时间依赖方式抑制ETA蛋白表达以及VSMC的增殖;反义寡核╉苷酸是通过反义机制实现对ETA蛋白和VSMC增殖的抑制作用.An狃tisenseendothelin┐1receptoroligonucl屈eotidein┐hibitvasc贻ularsmoothmusclecellproliferationandintimalhyperplasia雅Abstract:AIMTo谊evaluatetheinhibitiveeffectofantisen谥seendothelin-1receptoroligonucleotid卉eonVSMCgrowthandin淄timal①Cellmediumofrabbitaortawerehar颛vested，digestedand琢thedispersionswere涠cellsofpassage4～6w敢ereroutinelyusedto证studyafteridentifi筻19/19 cationwithα-actinantibody.②ODNantise糗nsesequencesweredeāsignedandscreenedt昙hroughGenebanktheseprocedures，eighte跛enphosphorothioate墟antisensecom-pleme鹑ntarytoETAcDNAwere桥synthesized，andeve再ntuallylabeledwith尬digoxinbywhichthes施equencesstabilitybeaug-mentedandmemb┒ranouspermeability摆tested.③MTTmethodw岍asusedtoevaluateDN碥AsynthesisinODNtre埘atedVSMC.④125I-ET-得1radiobindingassaytoETAandimmuno-his瞿tochemistrywereuti飨lizedtoexamineprot帏einexpressionofthe匮receptor，andtodisc懂ussrolesoftheODN.⑤轧ODNdis-solvedin200跸mLL-1F-127gelsolut潦ionatconcentration倪μmolL-1wereapplied稔tosurroundtheexpos齐edregionofcarotida犒rteryonthebasisofA湃irDrytheinti-malth闶icknessandluminaln⑧arrownesscouldbe①EフTA-ODNcouldbefound饺inculturedVSMCin12罘handgraduallyincre罴ased.②ETA-ODNatcon芷centra-tionof15μmo宋lL-1suppressedVSMCproliferation，whic八hshowedasignifican浮tactionin24h.③ETAp去roteinexpres-sionw︼asreduced，indicateデdbythephenomenasthatCPMprogressively畿19/19 decreasedin24h.④In裙timalthicknessandlu-minalnarrownesswるerelightenedafterETA-ODNETA-ODNsuppr后essesETAexpression∷andSMCproliferationinatimeandconcentrationdependentpla坫ysanimportantrolei吞nmediatingcultured嫖VSMCproliferatione崎xertsinhibitoryfun沌ctionthroughantise刚nsemechanism.0引言痒血管移植或动脉腔内成形术后血管内╁膜均不同程度地发生增生，严重的可致血浙管狭窄或再狭窄.内膜增生的细胞学基础翘是血管中膜平滑肌细胞向内膜迁移并增殖，因此若能控制血管SMC增殖即可实现珙抑制内膜增生.既往人们用化学药物，如涠阿斯匹林、潘生汀、肝素和类皮质激素等浼试图抑制血管内膜增生［1］，但效果均荏不理想.近年来的研究证明I型内皮素在诱导血管收缩和VSMC增殖方面起重要作用，在动脉粥样硬化的VSMC中，Ⅰ掐型内皮素受体mRNA表达显著增多［2霎］，而且ET-1可增加VSMC内3H理-TdR结合率［3］，增强PDGF诱诛导的DNA合成［4］.现已明确，ET醇在血管内膜增生中发挥着重要的促分裂效鳃应.作为基因治疗的一方面，反义技术已蚴逐渐成为血管领域的重要的治疗方法［519/19 ］.针对ET-1及其受体ETA在血管蛑SMC增殖和内膜增生中的重要作用，我嗬们合成了含18bp的ETA反义寡聚核育苷酸，并经硫代膦酸修饰，在离体SMC阢培养和动物在体模型基础上探讨ODNS对VSMC上ETA蛋白表达、SMC增寓殖和内膜增生的影响，为防治血管内膜增唪生和血管狭窄提供实验依据.1嬷材料和方法细胞培养无菌取家兔主动脉段，去内外膜置100mLL-1NBSDMEM培养液中，剪碎，吸总去DMEM，加L-1胰蛋白酶震荡傻消化45min，低速离心，弃组织块，收集上清液加培养液移至培养瓶，置37跸℃，50mLL-1CO2孵箱.取用第诡4～6代细胞，多余细胞分装冻存备用.19/19 SMC鉴定将SMC按每孔1×侉104个细胞转种于置有无菌载玻片的6踟孔板内，37℃，50mLL-1CO2祀孵箱内培养，细胞贴壁生长至一定密度时粉取出载玻片，免疫组化染色后观察.反义核苷酸的设计合成根据已克隆扁的大鼠ETA核酸序列［6］，经中科院旷上海生化所Genebank检索后，分别筛选并设计特异性高的含18bp的反睢义片段，DNA合成仪合成30A的寡核忤苷酸.同法合成相应的正义片段.另外合盅成标有地高辛的反义ETA10A，以验鹅证反义核酸的膜穿透性.5"端碱基硫代简磷酸化修饰以增加寡核苷酸在血清中的稳给定性.19/19 ODN的膜透性检测觥将地高辛修饰标记的ETAODN与SM柝C共培养，爬片生长，孵箱培养4，12镂，24和48h后取出玻片，通过抗体免疫组化呈色反应以显示ODN的细胞膜透勿性.每种因素重复3次.ETA蒌┐ODN对血管SMC增殖的作用MTT霓实验取第四代细胞接种96孔板，密弦度每孔1×104细胞，孵育48h，分裁别加入，和μmolL-1，设立正义对癞照、阴性对照和空白对照，每组3孔，培烹养12，24，48和72h后分别加入燕质量分数为50mgL-1的MTT，孵派育4h后再加入二甲基亚砜20μL，移至酶标仪测定光度值.细胞生长计数根据え上述结果，用15μmolL-1浓度的诖ETA-ODN观察对SMC生长的抑制苁作用.按1×104密度接种24孔板，希时间组和其他步骤同上，在倒置显微镜下少计算活细胞个数.19/19 ETA┐OD娅N对ETA蛋白表达作用放射受体结罾合分析法将经ETA-ODN处理过的细森胞制成悬浮液，加入125I-ET-1矢250μL，37℃孵育2h，离心弃上贿清，用冷DMEM快速洗3遍，进行γ计柁数.以加入10-7molL-1未标记圩的ET-1200μL后所得的每分计数馓作为非特异性结合率，样品的cpm减去筻非特异性结合的cpm为125I-ET式-1的特异性结合率.ETA┐ODN对血管内膜增生的作用的在体实验血管模型的建立和反义寡核苷酸的导入30mLL-1戊巴比妥钠静脉麻醉，啵家兔取仰卧位消毒后，沿颈正中切开皮肤。，显露颈动脉，轻柔剥离外膜后游离颈动檩脉长，上下无创夹阻血后，从一端注入空绞气，另一端抽出空气，持续10min，涪造成血管内皮细胞脱落.在血管周围注入懑4℃预[1][2][3]下一页19/19 冷镩、混有ETA-ODN的200mLL-遽1F-127多聚凝胶500μL，寡核镏苷酸的浓度为μmolL-1.F-12趣7在37℃时呈固态凝胶，待其由液态变仟为固态后缝合皮肤.动物分组健康成年家兔24只，体质量kg，雌雄不呆拘，随机分为3组，每组2只.一组为O梁DN处理组，其他两组为阴性对照组和空嚅白对照组，术后48h，1，2和4wk棺不同时间取材.取材时注意使血管不扭曲鞒，保持合适张力.微机图像分析砘标本切片图像经显微摄像机摄入图像萘分析系统后，计算血管增生内膜的厚度.涵其中内膜厚度以增生内膜厚度与中膜和内膜联合厚度的相对值表示，每组围绕管腔絮测10次，取平均值计算.19/19 统计骅学处理:组间采用团体t检验.黄2结果细胞培养及鉴定赐VSMC经传代培养后，细胞形态稳定，甥抗α-actin抗体免疫组化阳性，证陕实培养的细胞为VSMC.19/19 OD揩N纯度及膜透性检测通过抗体免疫组化呈色反应结果:4h阴性，12h弱阳瑚性，24和48h阳性.说明ETAOD醮N能在12h进入细胞内，并在24和4滥8h逐渐增多.ETR┐ODN蕺对血管SMC增殖的作用MTT光度艘值结果如Tab1.从表中所知，15μmolL-1的ETA-ODN24h与阴性对照组有显著性差异，48h与阴性孔对照组也有显著性差异;以培养后时间组泡比较，15μmolL-1ETA-OD堡N12与48h差异显著，12与72h也有显著性差异，说明15μmolL-眙1ETA-ODN对SMC增殖具有明显缤的抑制作用.正义对照组与阴性对照组相鞅近，说明正义寡核苷酸无效.表1加入E隧TA-ODN后VSMC的光吸度值矍细胞生长计数结果19/19 上述结果可见封15μmolL-1ETA-ODN具有焚明显抑制SMC增殖的作用，因此用上述珑浓度的ETA-ODN观察对SMC生长骰的抑制作用，表明有明显抑制VSMC生ɑ长的作用.表2加入ETA-ODN后V季SMC生长密度ODN对ETA蛋白墩表达的抑制作用通过125I-ET汾-1放射受体结合分析实验，经Gamma计数显示15μmolL-1的ETA嵝-ODN具有明显抑制ETA的表达.随钅培养时间的延长，ETA-ODN处理后丬cpm逐渐减少，到48h即有显著性差异;与对照组相比，24h即有显著性差轰异，说明ETA-ODN明显抑制ETA∞表达.表3加入ETA-ODN后VSMCETA┐ODN对血管内膜增藏生的抑制作用经反义基因导入后，结拔果显示ETA-ODN不仅减缓内膜增生穆的发展，而且对内膜增生具有明显的抑制涉作用.表4血管内膜相对厚度19/19 3叼讨论VSMC增殖和内膜增生是槲血管移植术、血管成形术后狭窄或再狭窄的主要原因［7］.当VSMC受外界因乌素刺激后，细胞内部通过一系列信号传导瘥系统作用，启动细胞内调节细胞增殖的基曳因表达，最终导致细胞增殖.其中，血管数活性因子在促进细胞增殖过程中起着重要戬作用.ET-1作为VSMC分裂增殖的嬷强效生物活性物质在诱导狭窄和再狭窄发诏生机制中占有重要地位［8］.过去研究镥已经证明，VSMC上ETA的表达与内挈膜增生存在正相关效应［9］，ET-1藉与ETA结合后触发的促分裂可能在内醺膜增生过程中发挥重要作用［10］.以廿前人们试图应用化学药物抑制VSMC增殖和内膜增生，但效果不理想，而且作用不特异.体外合成的反义寡核苷酸可特异兖与某些基因的DNA或mRNA结合，以脘阻止该基因的转录或翻译，达到削弱该基烙因的目的.本研究就是应用ETA反义寡核苷酸特异抑制ETA蛋白的表达，从而羸减弱ET-1促增殖效应.ET-1能显19/19 蒯著增加细胞内3H-TdR结合率，增强攫PDGF诱导的DNA合成，有人用3H-TdR结合率来反映细胞的增殖状态［袄11］.四唑蓝比色试验法是检测细胞生对长和存活的方法，它与细胞计数、软琼脂克隆试验和3H-TdR掺入试验有良好梯的相关性，而且灵敏度高，重复性好，操调作简便、经济、快速、易自动化，因此本顷实验采用MTT法检测细胞增殖情况.本溶研究经预实验摸索并结合文献［12］报道，发现15μmolL-1浓度的ET铮A对培养的血管SMC具有抑制作用，并通过膜透性检测证实ETA-ODN能于辎培养后24h进入细胞内且发挥作用，说明ETA-ODN以浓度和时间依赖方式ν抑制SMC增殖，细胞生长计数也显示有良好的相关性.实验还同时说明在本实验觏条件下ETA参与了VSMC的增殖过程ㄐ，这与国外一些作者的实验结果相佐［1ё3］.对细胞内相关基因蛋白水平的检测，能了解该基因在细胞功能活动中的活跃蝴程度.由于目前无市售ETA抗体，本实敢验采用放射受体结合分析法间接了解ET璞A蛋白表达情况，结果发现ETA-ODN作用24h后即有明显的抑制ETA表郯达的作用，说明ETA-ODN是通过反醇义途径实现对ETA的抑制.在体空气干佬燥模型与球囊导管模型有同样效率［14钨］，均可造成血管内皮细胞的脱落，继而婊诱发内膜增生.但空气干燥模型操作简便妒快捷，损伤均匀，效果确切.F-127是一种具有特定物理性质的多聚凝胶，在害4℃时表现为液态，37℃时聚合成凝胶桔状，利用这一特性，将一定浓度的寡核苷睦19/19 酸混合其中，转到动物体内后，由于温度乏上升，可迅速变为固态，使寡核苷酸较长簟期而缓慢地释放在血管周围，避免了短时协间内大量寡核苷酸进入体内的副作用［1踺5］.本结果显示ETA-ODN能减少艴增生内膜的厚度和管腔的狭窄，说明在体ё情况下ETA-ODN同样具有抑制SM鹞C增殖的作用.应用F-127可达到局茜部定点高浓度缓释寡核苷酸的作用，有效倏地提高了局部效应，但对载体的稳定性和瘼反义寡核苷酸的毒性还需作进一步研究.综上所述，ETA-ODN以浓度ケ和时间依赖性方式抑制ETA蛋白表达以瘾及VSMC的增殖;反义寡核苷酸是通过餍反义机制实现对ETA蛋白和VSMC增殖的抑制作用;在抑制血管内膜增生和V诺SMC增殖方面ETA-ODN显示出良舰好的临床应用前景.参考文献:［1］BorlandJA，Che捷sterAH，CrabbeS，Par呼19/19 kersonJB，CatravasJ嚏D，Yacoubactionofan莼giotensinIIandacti蠼vi-tyofangiotensin舭-convertingenzymei蚍nhumanbypassgrafts［J］.JThoracCardiov兰ascSurg，1998;116:2酉06-212.［2］Kikkaw狁aK，SaitoA，IwasakiH丿，BanY，YasoshimaA，Y隰a-mauchiKR，Hoshino呲T，Murataofcerebral螽va-sospasmbyanovel攵endothelinreceptor兕antagonist，TA-0201悟［J］.JCardiovascPha獾rmacol，1999;34:666萏-673.［3］YanagisaガwaH，HammerRE，Richa荑rdsonJA，WilliamsSC┄，ClouthierDE，Yanag迥isawaofendothelin-滋1/endothelin-Areceptor-mediatedsigna馓lingpathwayintheao姓rticarchpat-ternin┏ginmice［J］.JClinInvest，1998;102:22-3使3.［4］MoritaT，Kouぇrembanascellexpres虹sionofvaso-constri圬ctorsandgrowthfact蜴orsisregulatedbysm酐oothmusclecell-der磴ivedcarbonmonoxide脍［J］.JClinInvest，19棰95;96:2676-2682.19/19 雠［5］BennettMR，Schwa筇rtztherapyforangio胗plastyrestenosis，s蚋omecriticalconside樾rations［J］.Circulation，1995;92:1981-畿1993.［6］LinHY，KajiEH，Winkelandfunctionalexpres-siono盆favascularsmoothmu铷scleendothelin1rec甲eptor［J］.ProcNatlA届cadSci，1991;88:318严5-3189.［7］Masood衅I，PorterK，London糁19/19 amedia仞torofintimalhyperp缮lasiainorgancultureofhumansaphenousv叔ein［J］.BrJSurg，199哓7;84:499-503.［8］挟LiGY，XinXY，QianJX，屡Zhuroleofen-dothel郊in-1inhumanuterine脎leiomyomacells［J］.聘Di-siJun［12］LiGY另，XinXY，QianJX，ZhuY撞P，ZhangL，Dengendot阑helinAreceptorolig福onucleotideinhibit﹃shumanuter-ineleiomyomacellproliferation［J］.Di-siJunyi⒕DaxueXuebao，2000;2嵯1:360-362.［13］Ma固guireJJ，Davenportr瀚eceptorexpressiona╆ndpharmacologyinhu颚mansaphenousveingr鍪aft［J］.BrJPhar-macol，1999;126:443-45晚0.［14］HerbertJM，铐GuyAF，LamarcheI，Ma甘resAM，SaviP，Dolhyperplasiafollowingvascularinjuryisnot粞inhibitedbyanantis跃ensethrombinrecept√19/19 oroligodeoxynucleo颂tide［J］.JCellPhysi陇ol，1997;170:106-114.［15］SiroisMG，S堂imonsM，Edelmanolig冁onucleotideinhibit菩ionofPDGF-receptorsubunitexpressiond羝irectssuppres-sion茎ofintimalthickenin鬃g［J］.Circulation，1997;95:669-676.19/19